هارون الرشید که نمی توانست وجود امام هفتم علیه السلام را تحمل کند مجددا امام را دستگیر و برای همیشه زندانی کرد.
زمانی که ماموران خلیفه، برای دستگیری امام آمدند، آن حضرت را در منزل نیافته، به مسجد النبی صلی الله علیه و آله رفتند و امام را در حال نماز مشاهده کردند؛ اما مهلت ندادند که امام نمازش را به اتمام برساند و با همان حال ایشان را بازداشت کردند. هارون الرشید دستور داد تا امام را شبانه در یک محمل سرپوشیده به بصره برده، به حاکم بصره [عیسی بن جعفر] تحویل دهند. امام به مدت یک سال در زندان بصره بود، هارون به عیسی بن جعفر نوشت تا آن حضرت را به قتل برساند، اما او در پاسخ خلیفه عنوان کرد که من در این مدت، جز عبادت و نیایش، چیز دیگری از موسی بن جعفر علیهما السلام ندیده ام، اگر او را از من تحویل نگیری آزادش می کنم.
هارون، امام را از بصره به بغداد منتقل کرده و به «فضل بن ربیع» سپرد و از او خواست تا آن حضرت را به قتل برساند اما او نیز حاضر نشد در ریختن خون امام سهیم شود. پس از آن، امام را به «فضل بن یحیی» فرزند «یحیی بن خالد برمکی» وزیر هارون الرشید تحویل دادند، او امام را محترم شمرد و موجبات آسایش آن حضرت را فراهم آورد. وقتی گزارش برخورد خوب فضل را به هارون دادند، آنچنان برآشفت که در مجلس رسمی بر او لعن کرد و از اطرافیان نیز خواست، او را لعنت کنند و برای فرونشاندن خشم خود، صد ضربه شلاق به او زد. او سرانجام موسی بن جعفر علیهما السلام را به زندان «سندی بن شاهک» انداخت. «یحیی بن خالد» از سرپیچی پسرش، نزد خلیفه عذرخواهی کرد و به وی اطمینان داد تا خود کار را یکسره کند. او به بهانه ای به بغداد سفر کرد و به «سندی بن شاهک» دستور داد تا امام را به قتل برساند. [مقاتل الطالبین، ص 502 - 504]
در نحوه شهادت امام، مشهور آن است که آن حضرت را با خوراندن زهر مسموم کردند؛ [وفیات الاعیان، ج 5، ص 310] اما در نقل دیگری نیز آمده است که «سندی بن شاهک» و چند نفر دیگر آن امام همام را در میان فرشی پیچیده و چنان فشار آوردند تا به شهادت رسید. [تاریخ بغداد، ج 13، ص 31]
این واقعه دردناک بنابر نظر مشهور در 25 رجب سال 183 قمری در سن 54 یا 55 سالگی امام هفتم و پانزدهمین سال خلافت هارون الرشید واقع شد. [همان]
«والسلام علیه یوم ولد ویوم استشهد ویوم یبعث حیا»